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ELISA實(shí)驗(yàn)代測|百科

更新日期: 2024-03-13
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  ELISA是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù),可以用于檢測血液、尿液、唾液、霉菌、病毒、細(xì)菌等生物樣品中的蛋白質(zhì)、抗體、肽等生物分子。
 
  ELISA全名是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)的縮寫,是一種利用酶標(biāo)記化的抗體或反體與待檢測物(抗原或抗體)結(jié)合,從而間接或直接檢測目標(biāo)分子的技術(shù),屬于免疫學(xué)中的非放射性標(biāo)記方法之一。
 
  ELISA實(shí)驗(yàn)代測步驟:
 
  一般分為六個(gè)步驟:涂覆微孔板、酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)、樣品添加、次級(jí)抗體結(jié)合、添加底物、測量光密度。
 
  1.涂覆微孔板
 
  將捕獲抗體、配體或抗原涂覆在微孔板上,使之附著在微孔板的底部或壁上,固定在樣品檢測位置或加標(biāo)準(zhǔn)的位置。同時(shí),涂覆后還需要加入一些特殊蛋白或物質(zhì),例如牛血清白蛋白(BSA)等,將微孔板的其他部分進(jìn)行屏蔽,以防止非特異性結(jié)合。
 
  2.酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)
 
  將酶標(biāo)記化的初級(jí)抗體與樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng),待時(shí)間到達(dá)絕大部分初級(jí)抗體與待檢測物或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合時(shí),將液不沖洗干凈。
 
  3.樣品添加
 
  將待檢樣品加入涂覆好初級(jí)抗體的微孔板中,讓待檢樣品以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合到微孔板上涂覆好的初級(jí)抗體中。該過程也需要將板子洗液清洗干凈。
 
  4.次級(jí)抗體結(jié)合
 
  將酶標(biāo)記化的次級(jí)抗體加入孔內(nèi),經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間,使之與待測樣中的物質(zhì)結(jié)合。該步驟結(jié)束后,需要將板子進(jìn)行洗滌,以消除非特異性結(jié)合。
 
  5.添加底物
 
  將含有酶基團(tuán)的底物加入微孔板中,例如TMB、ABTS等底物,如果樣品物質(zhì)合適,底物在酶催化下會(huì)產(chǎn)生顯色反應(yīng)。直觀表示是微孔板中某些孔的液體呈現(xiàn)橘黃色,根據(jù)底物種類的不同,孔底深度和底物的反應(yīng)時(shí)間也會(huì)有所不同。
 
  6.測量光密度
 
  在吸光度計(jì)或ELISA檢測儀器上對(duì)微孔板進(jìn)行讀數(shù),根據(jù)微孔板中總體積、底物的反應(yīng)時(shí)間和吸收量來計(jì)算樣品中待檢測物質(zhì)的濃度。通常,結(jié)果是一個(gè)數(shù)字,可以根據(jù)該數(shù)字來評(píng)估待檢測物質(zhì)的存在程度或含量。
 
  實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
 
  1.微孔板的處理
 
  微孔板是ELISA實(shí)驗(yàn)中的重要物品,拆開之前必須放在干凈的環(huán)境中進(jìn)行消毒,盡量避免接觸銳器或其他銳利物品,使用完后及時(shí)封閉保存,避免受到污染。
 
  2.操作流程的嚴(yán)謹(jǐn)性
 
  實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格的操作流程和重復(fù)性,每個(gè)流程必須按照操作規(guī)程進(jìn)行,且操作者必須熟練掌握操作技巧和注意事項(xiàng),避免因操作不當(dāng)引起實(shí)驗(yàn)的誤差。
 
  3.化學(xué)品的正確使用
 
  實(shí)驗(yàn)中需要使用各種化學(xué)試劑,包括酶標(biāo)記的抗體、底物、緩沖液、洗滌液等,每個(gè)化學(xué)品都有其特殊的儲(chǔ)存、使用和處理方法,必須按照說明書的要求進(jìn)行正確使用,避免發(fā)生安全事故或影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 
  4.數(shù)據(jù)的分析
 
  ELISA測量數(shù)據(jù)的分析非常重要,必須進(jìn)行合理的分析和解釋,避免由于數(shù)據(jù)誤差或結(jié)果解釋不當(dāng)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)論的錯(cuò)誤。
 

 


 
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