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實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒|百科

更新日期: 2024-03-13
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  實(shí)時(shí)熒光PCR是一種高效、快速、靈敏的核酸檢測(cè)技術(shù),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒是分析的常用試劑,本說明書將詳細(xì)介紹其使用方法和注意事項(xiàng)。
 
  一、實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒組成
 
  1.TaqDNA聚合酶:用于DNA的擴(kuò)增,負(fù)責(zé)將引物與模板DNA的單鏈DNA酶加速退化并使其DNA合成。
 
  2.PCR反應(yīng)緩沖液:含有適當(dāng)?shù)木彌_劑,pH9.0,用于維持PCR反應(yīng)體系的酸堿度,包含MgCl2及其它試劑,在PCR反應(yīng)中也是擴(kuò)增的重要條件之一。
 
  3.dNTPs混合物:包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種核苷酸,是DNA分子的構(gòu)成單位和擴(kuò)增反應(yīng)的原料。
 
  4.SYBRGreenI染料:用于熒光定量的染料。
 
  5.引物:包括前向和反向引物,定位于待擴(kuò)增的基因序列5’端和3’端;
 
  二、試劑盒存儲(chǔ)
 
  實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒應(yīng)在-20℃下儲(chǔ)存,避免陽光直射和高溫。試劑從冷凍箱取出后,空冰盒應(yīng)放回-20℃冰箱中保存;反復(fù)凍融次數(shù)不宜過多,應(yīng)遵循一次性使用的原則。
 
  三、試劑配制
 
  1.TaqDNA聚合酶
 
  將試劑盒中的TaqDNA聚合酶稀釋至10U/μL,如果使用種類不同的TaqDNA聚合酶,需按照不同試劑盒的說明書配制濃度。
 
  2.PCR反應(yīng)緩沖液
 
  取10XPCR反應(yīng)緩沖液一袋,加入適量的雙蒸水再混合融合,在處理前搖勻。
 
  3.dNTPs混合液
 
  將試劑盒中的dNTPs混合液稀釋至各1mM濃度,即每個(gè)dNTPs的表面濃度為10mM。
 
  4.引物
 
  引物需由用戶根據(jù)需要設(shè)計(jì)并合成,最佳濃度為0.2μM,初次擴(kuò)增可以進(jìn)行濃度梯度PCR。
 
  四、PCR反應(yīng)體系
 
  PCR反應(yīng)體系根據(jù)不同試劑盒而異,但以下條件必須滿足:
 
  1.反應(yīng)總體積為20μL;
 
  2.TaqDNA聚合酶濃度為0.02U/μL;
 
  3.濃縮PCR緩沖液為10X,含有適量的鎂離子,按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的模板DNA濃度進(jìn)行配制;
 
  4.引物濃度為0.2μM;
 
  5.dNTPs濃度均為1mM。
 
  五、實(shí)驗(yàn)操作
 
  1.取模板DNA
 
  提取模板DNA應(yīng)避免污染,可通過UV檢測(cè)濃度。
 
  2.根據(jù)擴(kuò)增位點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的引物
 
  應(yīng)合理設(shè)計(jì)引物,確保引物的特異性、合適的長度、最佳的表面濃度、最適的擴(kuò)增溫度、避免二聚體生成等。不同種類的引物按不同的擴(kuò)增步驟使用,避免混合誤判。同時(shí),應(yīng)使用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件,如Primer3、Oligo等,確定引物序列。
 
  3.PCR反應(yīng)設(shè)置
 
  根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行PCR反應(yīng)體系設(shè)置,并通過實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證修正,確保反應(yīng)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。反應(yīng)過程中應(yīng)進(jìn)行一次性使用、避免污染、使用厭氧比色卡等方法進(jìn)行檢測(cè)控制。
 
  4.擴(kuò)增優(yōu)化
 
  對(duì)PCR反應(yīng)能否成功,引物濃度、反應(yīng)緩沖液pH值、MgCl2濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間等條件均有很大影響,應(yīng)花費(fèi)相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,并針對(duì)不同的DNA片段進(jìn)行個(gè)性化優(yōu)化。
 
  5.片段純化和測(cè)序
 
  提取PCR產(chǎn)物,并將其用試劑盒進(jìn)行純化;成品片段用測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè),樣品需要通過ABI310測(cè)序儀檢測(cè)、測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)、樣品的星號(hào),出欄和質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有較高的強(qiáng)相關(guān)性。對(duì)出現(xiàn)熒光異常需開發(fā)相關(guān)處理規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)化解釋方法,確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
 
  六、注意事項(xiàng)
 
  1.試劑盒應(yīng)避免長時(shí)間在高溫環(huán)境下存放,否則可能導(dǎo)致試劑盒中的部分試劑失效;
 
  2.PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備和加藥時(shí),應(yīng)使用專門的工具,在實(shí)驗(yàn)室避免交叉污染;
 
  3.擴(kuò)增條件須符合說明書說明,必須按照說明書中的條件嚴(yán)格執(zhí)行,否則可能導(dǎo)致試劑盒效果不佳;
 
  4.試劑盒內(nèi)各部分試劑的含量應(yīng)按說明書標(biāo)記為準(zhǔn),避免誤操作導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
 
  七、結(jié)論
 
  實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒是提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性的重要工具。通過科學(xué)準(zhǔn)確地使用和操作,可確保擴(kuò)增效果和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 


 
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